Forschungsprojekte im iNano

 

Salmonellenschnelltest

In Deutschland hergestellte Lebensmittel haben frei von Salmonellen zu sein, so verlangen es der Verbraucherschutz und das deutsche Lebensmittelrecht. Ergänzend verpflichtet eine EU-Verordnung alle Mitgliedsstaaten in gleicher Weise. Lebensmittelhersteller sind daher auf eine regelmäßige Überprüfung ihrer Produkte angewiesen. Da insbesondere bei kleinen und mittleren Unternehmen (KMU) ein Salmonellennachweis aus Personal- und Kostengründen nicht durchgeführt werden kann, besteht in der Branche eine hohe Abhängigkeit von externen, zertifizierten Laboratorien. Ein weiterer Nachteil ist zurzeit die lange Untersuchungsdauer von mehr als 3 Tagen, die einen entsprechenden Einfluss auf die Wirtschaftlichkeit von Prozessabläufen hat.

Um KMU´s eine Entlastung sowohl von wirtschaftlicher als auch von juristischer Seite zu ermöglichen, sollte ein idealer Salmonellenschnelltest (den es bisher am Markt nicht gibt) die folgenden Eigenschaften aufweisen:

Zur Realisierung des geplanten Salmonellenschnelltests hat ein Team der HSNR, bestehend aus Dr. Peter Klauth (Mikrobiologe), Prof. Büddefeld (Mikroelektroniker und Direktor des iNano Institutes), Prof. Manfred Rietz (Lebensmittelchemiker) und Michael Stelz (Betriebswirt) in interdisziplinärer Zusammenarbeit ein vollständiges Konzept  entwickelt und patentiert.

Die Salmonellen werden mit dem neuen Verfahren in 4 aufeinander aufbauenden Stufen jeweils spezifisch erfasst:

Zur Durchführung des Salmonellennachweises werden überwiegend handelsübliche Reagenzien (z. B. Dynabeads) verwendet. Die benötigten Molecular Becons mit Selten-Erd-Farbstoffen und zeitaufgelöst messende Fluoreszenzdetektoren für die Real-Time-PCR gibt es nicht am Markt und mussten speziell entwickelt werden. Sie sind patentrechtlich geschützt. Störstrahlung ist neben reaktionsblockierenden Substanzen (Inhibitoren) das Hauptproblem bei der Anwendung der Real-Time-PCR für Lebensmittelproben. Durch die Verwendung von Selten-Erd-Farbstoffen in den Molecular Beacons ergibt sich die Möglichkeit, die langlebige Strahlung der Selten-Erd-Farbstoffe von der Störstrahlung auf der Zeitdomäne zu unterscheiden, ohne dass ein gut ausgestattetes Labor oder Fachpersonal notwendig wäre. Die Intensität der Störstrahlung hat dabei keinen Einfluss auf die Empfindlichkeit der Messung. Die Menge an Inhibitoren wird durch die Verwendung magnetischer Immunkörper, welche eine Abtrennung der umgebenden Lebensmittel auf einfache Weise ermöglicht, verringert.

Die Kunden der neuen Technologie sind erstmals in der Lage, schnell und sicher (gerichtsfest) selbst im Unternehmen die Einwandfreiheit ihrer Lebensmittel zu untersuchen. Der damit einhergehende Kundennutzen ist eine Reduzierung der Untersuchungszeit um 90 %(3 Stunden anstelle von 36 Stunden), was eine erhebliche Kostenersparnis bedeutet, sind doch viele betroffene Lebensmittel nur wenige Tage im Umlauf.

Legionellendetektor

Mobiler und vollautomatischer Legionellendetektor zur Erfassung von Legionellen in wasserführenden Leitungen. Zur Bestimmung der Menge an Legionellen (genauer: Legionella pneumophila) in wasserführenden Leitungen wie Trinkwasserleitungen ist ein Gerät entwickelt worden, welches vollautomatisch ein definiertes Volumen an der zu überprüfenden Wassermenge entnimmt und auf die Menge an vorhandenen Legionellen untersucht. Das Ergebnis wird dem Nutzer via Display oder e-mail etc. direkt mitgeteilt. Die gesamte Untersuchungsdauer beträgt etwa 1,5 bis 2 Stunden. Technologisch wird dieser Test in 5 Stufen durchgeführt, von dem der Nutzer jedoch nichts merkt. Der Nachweis basiert auf der Verwendung von immunomagnetischer Separation mit nachgeschalteter Quantifizierung der Zellen durch einen DNA-Fluoreszenzfarbstoff.

Erstmals ist es möglich, den nach § 3 Nr. 2 Buchstabe c TrinkwV 2001 geforderten Nachweis auf Abwesenheit von Legionellen mittels eines mobilen und automatisch arbeitenden Gerätes ohne Fachpersonal und  Verletzung des Infektionsschutzgesetzes § 44 ff. durchzuführen. Der bisherige Stand der Technik sieht eine Probennahme vor Ort und den Nachweis in einem Handelslabor oder Labor des Gesundheitsamtes vor.

Mit diesen Methoden können die großen zu untersuchenden Wassermengen in der seit 2001 geltende Verordnung vorgeschrieben ist, problemlos analysiert werden. Außerdem  entfallen die hohen Kosten der vielen Einzelanalysen.

Proteinmarkierung mit Lumineszenzfarbstoffen

Diagnostische Reagenzien gehören zum großen Teil der Gruppe der Proteine (Eiweißkörper) an, weithin bekannt sind hier die sogenannten Antikörper. Zum Nachweis einer Krankheit oder für die Routineanalytik werden diese Proteine mittels Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Die markierten Antikörper binden dann an z.B. bestimmte Stellen im Gewebe oder innerhalb einer Testumgebung. Danach können sie durch optische Detektorsysteme erfasst werden.

Der Markt für „Advanced Staining Applications“ (Titel Roche) liegt zurzeit bei 1 Mrd. € jährlich und wächst mit 25 % pro Jahr (Quelle: Lumiphore.com). Die hohen Zuwächse sind begründet in der immensen Nachfrage für innovative neue Fluoreszenzfarbstoffe für immer bessere, d.h. sensitivere Nachweisverfahren. Sind die Grenzen der klassischen Farbstoffe ausgereizt, kann die Verwendung sogenannter Selten-Erd-Chelatkomplexe diese Grenzen überwinden. Selten-Erd-Chelatkomplexe zeichnen sich durch hohe Quantenausbeuten (hohe Leuchtintensität im Vergleich zum eingestrahlten Licht) und eine lange Strahlungslebensdauer aus. Letztere ermöglicht es, kurzlebige Störfluoreszenzen, welche die Nachweisgrenze durch Überblendung verringern, komplett auszublenden. Dies geschieht mittels zeitaufgelöst messender Detektoren.

Proteinmarkierungen mittels Selten-Erd-Farbstoffen sind in geringer Zahl auf dem Markt erhältlich, wobei keines dieser Produkte alle Vorteile des iNano Verfahrens in sich vereint (einfache Handhabung, keine Aufarbeitungsverluste, sehr hohe Leuchtstärke und Preiswert).

Speziell die Punkte „keine Aufarbeitungsverluste“ und „Preiswert“ sind herauszustellen. Das iNano Verfahren verursacht weniger als 1 % Aufarbeitungsverluste, das beste kommerziell erhältliche Kit erreicht 10-40 %.

Der Preis kommerzieller Selten-Erd-Farbstoff Kits liegt um den Faktor 40 höher als für Proteinmarkierungsverfahren der letzten Generation (Quelle: Invitrogen.com; LanthaScreen). Absolut sind diese Farbstoffe mit 4-5stelligen Preisen pro mg extrem teuer, was einem Preis von mehren Milliarden € pro Kilogramm entspricht. Der iNano Farbstoff ist Größenordnungen preiswerter herstellbar.

Lumineszierende Nanopartikel

Die lumineszierenden Nanopartikel sind Teil einer Plattform nanoskaliger Träger, die mittels  verschiedener Substanzen beladen werden können. NUCLAS (Nanoscalic Universal Carrier for Luminescent and Antimicrobial Substances) ist eine neuartige biokompatible Verpackung für Lumineszenzfarbstoffe und antimikrobielle Substanzen. Vereinfacht kann man sich NUCLAS als einen Nusscreme-Sandwich vorstellen: die beiden wasserlöslichen Toastscheiben bilden die Verpackung, zwischen ihnen liegt die zu transportierende wasserunlösliche Nusscreme. Erfunden wurde NUCLAS von einem interdisziplinären Team an der HS Niederrhein und der FH Münster [3].

Analog zum anschaulichen, makroskopischen Beispiel des Sandwiches lassen sich mit NUCLAS u.A. wasserunlösliche Substanzen oder antimikrobielle Stoffe biokompatibel einpacken. Die Verpackung selbst kann so modifiziert werden, dass Biomoleküle anzukoppeln oder sich in einem dazu geeigneten chemischen Milieu anzureichern. Die Verpackung ist sehr gut als Additiv für Polymere anwendbar. Basis dieser Technologie sind nanoskalige Tonminerale, sogenannte Laponite, die im großindustriellen Maßstab preiswert verfügbar sind. Dieses Rohmaterial wird vielen Werkstoffen und Produkten als Additiv beigemischt und seine Verbreitung und weitestgehende Verträglichkeit ist dadurch bereits gesichert.

Genau untersucht ist die Verwendung als Verpackung und Transporter für Fluoreszenzfarbstoffe [4]. Derartige Farbstoffe mit speziellen Lumineszenzeigenschaften werden für die Markierung von Biomolekülen oder für das Branding von hochwertigen Produkten verwendet.

Viele der effizienten Lumineszenzfarbstoffe auf dem Markt sind nicht biokompatibel, weil nicht wasserlöslich. Eine Modifizierung hin zu einer Wasserlöslichkeit führt oft zum Verlust der Leuchteffizienz. NUCLAS umgeht dieses Problem durch Verpackung in die Sandwich-Struktur. Die Tonmineral-Verpackung ist chemisch einfach zu modifizieren, ohne dass die verpackte Substanz verändert wird oder sich deren Leuchteffizienz verringert. Ein weiterer Vorteil ist die Transportkapazität von NUCLAS: Anstelle von einem angekoppelten Farbstoffmolekül sind bis zu 400 Farbstoffmoleküle an ein Biomolekül ankoppelbar und somit ist die Lumineszenz des Biomoleküls intensiver und besser detektierbar. Bedeutsam ist der Einsatz von sehr hellen Markierungen bei der Durchflußzytometrie. Die Durchflußzytometrie wird hauptsächlich für Blutuntersuchungen angewendet. Um dabei eine einzelne Zelle, mit wenigen Andockmöglichkeiten für Antikörper, zu erfassen, werden derzeit Kristalle eingesetzt, die auf vielen einzelnen Farbstoffen bestehen und somit heller leuchten als ein einzelner Farbstoff. Viele dieser Kristalle sind hochgiftig und müssen vor der Anwendung verkapselt werden, was die Herstellungskosten erhöht und Riskiken bergen kann.

NUCLAS kann außerdem für mikrobielle Beschichtungen von Oberflächen, als Zugabe zu Flüssigkeiten und als Medizinprodukt zur Verwendung im menschlichen Körper angewendet werden, wenn anstelle von Lumineszenzfarbstoffen Silberverbindungen eingeschlossen werden. Erste Untersuchungen zu ausgewählten Silberverbindungen zeigten eine zeitabhängige Freisetzung von Silberionen, wie sie von Medizinern und Hygienefachleuten gefordert wird.

Zu guter Letzt sei auf die beachtlichen Möglichkeiten der Oberflächenmodifikation hingewiesen, die sogar die Löslichkeit in organischen Medien und somit z.B. die Anbindung an Polymergerüste erlaubt. Daher ist NUCLAS auch für das Branding von hochwertigen Polymerprodukten (Textilien, biomedizinische Kunststoffe, Cremes etc.) optimal geeignet: Tonmineral als Ausgangsmaterial wird diesen Produkten bereits zu an

Der Fluidshutter als optischer Detektor für die Nutzung von Lumineszenz-markierungen in der Durchflußzytometrie

Der Fluidshutter, als Patent angemeldet, ermöglicht erstmals die uneingeschränkte Verwendung von Selten-Erd-Chlatkomplexen in der Durchflußzytometrie und stellt die gerätetechnische Komponente dar. Durch einen variablen Ortsversatz zwischen Anregung und Emission wird auf einfache Art und Weise eine mechanische Blende erzeugt, welche eine zeitaufgelöste Messung von Selten-Erd-Farbstoffen mit ihren langen Fluoreszenzlebenszeiten ermöglicht. Mit dem Fluidshutter ist es zudem möglich, die chemische Umgebung des angekoppelten Selten-Erd-Farbstoffes zu bestimmen, was eine einfache Unterscheidung zwischen strukturell ähnlichen Beads und Zellen ermöglicht.

Plagiatschutz für hochwertige Polymere und Oberflächen

Im zunehmenden Maße melden Wirtschaft, Polizei- und Zollbehörden Fälle von Marken- und Produktpiraterie, Fälschungen und Plagiaten. Während früher hauptsächlich Luxus- Konsumartikel wie Markentextilien und -kosmetik von Plagiaten betroffen waren, gilt dies mittlerweile für alle Bereiche des wirtschaftlichen Handelns und das mit jährlich deutlich zunehmendem Ausmaß. Sensible Bereiche wie Medizinprodukte schaden Plagiate besonders.

Produkte mit hoher Wertschöpfung oder sehr hohen Kosten sind für Produktpiraten besonders attraktiv. Dementsprechend liegt der Schaden dann auch meist bei hochqualifizierten Herstellern. Schätzungen des so entstehenden weltweiten Schadens sind durch die illegalen Geschäfte der Produktpiraterie mit einer hohen Dunkelziffer behaftet und schwanken deshalb je nach Quelle erheblich. Ein Anteil von ca. 10 % am Welthandel und damit rund 500 Milliarden Euro darf aber angenommen werden.

Der Anteil an Piraterieware steigt stetig in erschreckendem Maße. Während im Jahre 1996 Ware für „nur“ 1 Mio. vom Zoll beschlagnahmt wurde, wuchs die Zahl in nur 9 Jahren um das 200fache auf 213 Mio. im Jahre 2006. Der DIHK schätzt den volkswirtschaftlichen Schaden durch Produkt- und Markenpiraterie allein in Deutschland auf 30 Milliarden Euro jährlich. Zurzeit schätzt man, dass in Deutschlandallein 70.000 Arbeitsplätze in Europa ca. 300.000 Arbeitsplätze Opfer der Produktpiraterie geworden sind.

Somit ist für jedes High-Tech-Unternehmen eine kostengünstige aber fälschungssichere Erkennungs- und Markierungsmethode wünschenswert.

Das iNano entwickelt Anwendungen auf der Basis von neuartigen Fluoreszenzfarbstoffen, für den (1) internen und (2) externen Plagiatschutz von hochwertigen Polymeren und Oberflächen in Kombination mit einem neu entwickelten Handheld-Detektor für deren Erkennung.

(1)   Intern bedeutet dabei: die Einmischung der Fluoreszenzfarbstoffe in bestehende Formulierungen (flüssig, pulverförmig oder pastös) von Polymeren. Mit diesen neuartigen Farbstoffen ist es möglich, einen definierten Farbpunkt (Farbwert) einzustellen, der mittels eines Handheld-Detektors ausgelesen werden kann. Mit diesem System besteht zusätzlich die Möglichkeit durch unterschiedliche Farben Codierungen über den Herstellungszeitpunkt in die Materialieneinzubringen und dadurch beispielsweise im „eingebauten“ Zustand nachweisen zu können, dass das Produkt zum Zeitpunkt des Einbaus bereits nicht mehr verwendet werden durfte.

(2)   Extern bedeutet eine Modifikation der Oberflächen von Polymeren, die auch nachträglich aufgebracht werden kann.

Hochwertige z.B. Medizinprodukte wie Prothesen und Cremes können so intern, Gerätegehäuse, Bauteile extern markiert werden.

Die technische Machbarkeit wurde gezeigt, derzeit wird eine Anwendung für hochwertige Schmier- und Klebstoffe für einen mittelständischen Betrieb entwickelt, der mit öffentlichen Fördermitteln unterstützt wird. 

Funktionalisierungen von Textilien mittels nanoskaliger Schichtsilikate


Der Schutz von Mensch und Umwelt ist in allen gesellschaftlichen Bereichen ein wichtiges Anliegen. Eine wesentliche Rolle beim Schutz des Menschen vor gefährlichen Einflüssen spielen Bautextilien und vor allem Schutzbekleidung. Solche Funktionskleidung kann bidirektional wirken und sowohl den Benutzer als auch seine Umwelt abschirmen. Menschen, die aufgrund ihres Berufes hohen Gefahren durch Kontaminationen von außen mit Xenobiotika (= körperfremden chemischen Stoffen) ausgesetzt sind, benötigen Schutzkleidung, die besonders hohen Anforderungen genügt. Zu diesem Personenkreis gehören Angehörige der Feuerwehr, der Polizei, der Hilfswerke im Katastrophenschutz sowie des Militärs. Aber auch Gefahren in alltäglichen Bereichen von Beruf, Haus und Garten (Applikation von z. B. Pflanzenschutzmitteln oder Lack) kann das Anlegen von Schutzkleidung erforderlich machen, die auf die gesundheitlichen Erfordernisse des Benutzer zugeschnitten sein und einen größtmöglichen Schutz bieten muss. Beschichtungen auf Textilien, deren Komponenten in der Lage sind, Xenobiotika zu adsorbieren und damit verhindern, dass diese in Kontakt mit der menschlichen Haut gelangen, sind eine Möglichkeit, Schutzkleidung effektiver zu machen und längere Tragezeiten zu erlauben.

Bekannt und etabliert sind Beschichtungen mit abweisender Wirkung, z. B. in Form von hydrophoben Schichten als Antischmutzausrüstung von Teppichen, Polstern oder auch Bekleidung. Diese sind jedoch nur bedingt in der Lage, das Durchdringen von Xenobiotika zu verhindern. Andererseits existieren Substanzen, die eine hohe Absorptionswirkung für chemische Stoffe aufweisen, wie z. B. Schichtsilikate oder Mikrogele. Schichtsilikate, auch Nanoclays genannt, sind preiswerte, im Tonnenmaßstab erhältliche Tonmineralien mit breitem Anwendungspotenzial (z. B. eingesetzt als Füll- bzw. Hilfsstoffe in Farben, Kosmetika und Arzneimittel, Adsorptions-/Entfärbe-/Fällungsmittel für die Abwasserreinigung); ihre Ungiftigkeit wurde vom Bundesinstitut für Risikobewertung bereits bestätigt.

Nanoclays können in modifizierter Form an Textilien permanent angebunden werden und diese vor Abrasion und weiteren physikalischen oder chemischen äußeren Einflüssen schützen. In Abgrenzung zu bisher gebräuchlichen Adsorbern wie Aktiv- oder Kugelkohle versprechen textile, Nanoclay-basierte Beschichtungen einen hohen Tragekomfort mit guten haptischen Eigenschaften. Durch Modifizierung der schichtförmigen Tonmineralien sowohl auf der äußeren als auch der inneren Oberfläche können verschiedenste Eigenschaften wie erhöhte Hydrophobie oder auch antimikrobielle Wirkung mit Hilfe der Nanoclays direkt auf die Faser gebracht werden.

Es werden Beschichtungen mit Fängerwirkung gegenüber Xenobiotika entwickelt und Textilien mit diesen Beschichtungen hydrophob ausgerüstet, um sie als textile, regenerative „Fänger“ und temporäre Speicher für Xenobiotika zu nutzen. Die aufgenommenen Substanzen sollten dann entweder durch einen Waschvorgang entfernt oder, im Falle von aqua-toxischen Verbindungen, durch katalytische Prozesse abgebaut werden.

Das ausgezeichnete Quellverhalten dieser Schichtsilikate wurde in der Hochschule Niederrhein u. a. dafür genutzt, über Kationenaustauschreaktionen Alkylammoniumtenside in die Zwischenschichten einzulagern, um so als Fänger und temporäre Speicher für Xenobiotika zu wirken. Die Adsorption solcher Stoffe kann dabei sowohl aus wässrigen Systemen als auch aus der Gasphase erfolgen, so dass auch die Adsorption von Schadstoffen aus der Luft möglich ist. So wurden modifizierte Tone hergestellt, deren Adsorptionskapazität um ein Vielfaches höher ist als die von herkömmlichen Tonmineralen. Die mit Alkylammoniumionen modifizierten Tonmineralien haben demzufolge ein starkes Haltevermögen für gebundene Umweltgifte im Inneren. Mitarbeiter der Hochschule Niederrhein haben in der Vergangenheit weit reichende Untersuchungen zur Adsorption von Xenobiotika an Organoclays (organisch modifizierten Tonmineralpartikeln) durchgeführt und besitzen Spezialkenntnisse zur Anbindung von Alkylammoniumtensiden an Tonmineralpartikel zum Erzielen der gewünschten Fängerfunktion.

Autonom fliegende Roboter als Plattformen für Umweltsensoren

Der Bedarf und die Anwendung von Umweltsensorik hat in den letzten Jahren immer stärker an Bedeutung gewonnen. Angefangen bei Temperaturaufnahmen, Langzeitmessungen von Feinstaub an Stellen hoher Verkehrsdichte sowie die Bestimmung mikrobieller Belastungen sind es gerade die ortsvariablen Messungen, die zunehmend interessanter werden. Die Nutzung hochauflösender Sensorik findet stationär und mit entsprechendem Personalaufwand statt.

Durch die Verwendung von kleinen und leichten Fluggeräten erübrigt sich eine feste Aufstellung von Analysestationen. Die Flexibilität dieser Umwelterfassung ist groß. Innerhalb eines Tages können mehrere Orte beprobt werden. Ganz wichtig ist dies in Notfällen oder konkreten Verdachtsfällen, die schnell dokumentiert werden müssen.
Der Ökobauer hat natürlich ein Informationsinteresse daran, ob genmanipuliertes Saatgut oder Pollen andersartiger Pflanzen in seine Felder einweht und sich einkreuzt. Mit tels professionellen Quadrocoptern ist es möglich, mit den am iNano entwickeltem Pollensammler als Nutzlast, Pollen einzusammeln und diese mit hochgenauem GNSS positionsreferenziert aufzuzeichnen. Durch die Kombination von Ortsvariabilität und Zeitvariation ergeben sich so hochnützliche Informationen über die Polleneintrag anhand von Wind und Wetterdaten. Eine verlässliche Aussage über die Herkunft unerwünschter Pollen kann so getroffen werden.

Die Verwendung zuverlässiger Fluggeräte wie sie die Firma microdrones derzeit anbietet ist Basis für die Nutzung der iNano-Sensorik. Die Verknüpfung von Fluggerät und Sensorik bietet so für Direktanwender und auch Forschungsprojekte einen mehrfachen Nutzen, sei es durch Kostenreduzierung gegenüber Errichtung ortsfester Messanlagen, als auch durch die systemimmanente Flexibilität und vergrößerten Erfassungsbereich durch den Flugbetrieb mit nur einem einzigen Sensor.

 

[1] Polymerasekettenreaktion, vermehrt (amplifiziert) spezifisch Abschnitte des Erbgutes.

[2] Sonden, die nur in Anwesenheit eines spezifischen Amplifikates leuchten.

[3] Kynast, Lezhnina, Büddefeld, Klauth, Rietz: „Modifikation von Schichtsilikaten für die Lumineszenzaktivierung“, PCT/EP 2010/001663

[4] Klauth, Büddefeld e.a.: „Applikation nanoskaliger Lumineszenzpartikel für bioanalytische und biochemische Verfahren“, eingeladener Vortrag, 2. NRW Nano-Konferenz, Dortmund 22.-23. Juni 2009

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